近年，隨著國(guó)內(nèi)益生菌產(chǎn)業(yè)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，菌體的分離濃縮技術(shù)已成為工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)。菌體濃縮是將菌體與培養(yǎng)液分離的過(guò)程，處理過(guò)程要求在保持菌體活性的前提下，獲得較高的濃縮倍數(shù)和菌體收得率。濃縮方法主要有離心法和膜過(guò)濾法。離心分離法的問(wèn)題是離心力的剪切作用和間隙操作的氧損傷造成菌體的死亡率增高。
陶瓷膜過(guò)濾技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是操作條件溫和，對(duì)菌體活性影響較小，過(guò)濾系統(tǒng)可與發(fā)酵設(shè)備相連，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化連續(xù)生產(chǎn)。到目前為止，國(guó)內(nèi)的膜分離技術(shù)僅在少數(shù)生物制劑中有所應(yīng)用，應(yīng)用陶瓷膜過(guò)濾濃縮益生菌培養(yǎng)液，還處于實(shí)驗(yàn)研究階段，工業(yè)化裝置的運(yùn)行還未見報(bào)道。
在膜技術(shù)的應(yīng)用中，原料特性和操作條件對(duì)膜分離性能有重要影響，根據(jù)原料的特性選用操作系統(tǒng)，優(yōu)化操作參數(shù)是應(yīng)用性研究的主要內(nèi)容。本實(shí)驗(yàn)采用100nm陶瓷膜中試設(shè)備過(guò)濾濃縮益生菌培養(yǎng)液，目的是考查關(guān)鍵操作參數(shù)和濃縮效果，優(yōu)化操作參數(shù)和清洗方法，為放大生產(chǎn)提供技術(shù)準(zhǔn)備。
1實(shí)驗(yàn)材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)裝置
頗爾公司單支膜管的陶瓷膜中試實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)用陶瓷膜柱:ExekiaMembralox陶瓷膜柱，型號(hào)為1P1960GL/SD/100nm。膜有效面積:0.36m2。水過(guò)濾濾芯:ABU0.07P/1.0um。物料預(yù)過(guò)濾袋式濾器:MO200/200um。清洗用水:軟化水。化學(xué)清洗劑:分析純氫氧化鈉、分析純次氯酸鈉。
1.2益生菌培養(yǎng)液
企業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)，濕重2.8%～3.5%(w/w)，pH3.8～414，菌體數(shù)量>4×108cfu/mL。
1.3實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1活菌計(jì)數(shù)法
MRS培養(yǎng)基，平板計(jì)數(shù)法。
1.3.2測(cè)定過(guò)濾通量與過(guò)膜壓力關(guān)系的方法
在指定的速度下，保持料液的溫度不變，開放回流閥，關(guān)閉濾出閥，在系統(tǒng)內(nèi)循環(huán)料液，待系統(tǒng)穩(wěn)定后緩慢打開濾出閥，將滲透液和回流液返回至供料罐中，調(diào)節(jié)初始過(guò)膜壓力在指定値，每運(yùn)行30min調(diào)高過(guò)膜壓力0.3bar，記錄過(guò)濾通量和過(guò)膜壓力數(shù)值，直至過(guò)濾通量不再隨過(guò)膜壓力變化為止，制作過(guò)濾通量與過(guò)膜壓力的關(guān)系曲線。
1.3.3測(cè)定過(guò)濾通量與濃縮倍數(shù)關(guān)系的方法
保持其他參數(shù)不變，在系統(tǒng)內(nèi)循環(huán)益生菌培養(yǎng)液。待系統(tǒng)穩(wěn)定后，緩慢打開濾出端閥門，通過(guò)調(diào)整供料泵，使過(guò)膜壓力恒定在數(shù)值下進(jìn)行過(guò)濾。過(guò)濾濃縮時(shí)，始終保持循環(huán)罐內(nèi)液體體積在50L左右。當(dāng)過(guò)濾通量下降到一定數(shù)量，停止往循環(huán)罐內(nèi)添料，直至濃縮過(guò)濾結(jié)束。過(guò)濾濃縮過(guò)程中，每濾出20L料液，記錄過(guò)濾通量和濾出液體積，計(jì)算濃縮倍數(shù)，制作過(guò)濾通量與濃縮倍數(shù)的關(guān)系曲線。
2結(jié)果與分析
2.1膜過(guò)濾對(duì)菌體活性的影響
2.1.1切向流速對(duì)菌體活性的影響
在切向流速分別為2m/s、3m/s、4m/s和5m/s條件下，循環(huán)原料30min以上，采集回流液體樣本，檢測(cè)活菌數(shù)量，同時(shí)采集在靜置相同時(shí)間的樣本作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，陶瓷膜濾出端閥門處于關(guān)閉狀態(tài)，物料溫度始終控制在23～25℃之間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
表1結(jié)果顯示，在不同切向流速下活菌數(shù)量處在同一數(shù)量級(jí)，說(shuō)明切向流速所產(chǎn)生的剪切作用對(duì)菌體的活性影響較小。
2.1.2原料循環(huán)時(shí)間對(duì)菌體活性的影響
原料在系統(tǒng)內(nèi)循環(huán)，濾出液返回原料罐。在循環(huán)期間，每間隔一定時(shí)間采樣，進(jìn)行活菌數(shù)量檢測(cè)。原料在系統(tǒng)內(nèi)連續(xù)循環(huán)7h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。
從表2中數(shù)據(jù)可見，原料在系統(tǒng)中循環(huán)的時(shí)間對(duì)活菌數(shù)影響不明顯。在膜過(guò)濾系統(tǒng)中，影響菌體活性的主要因素有泵的剪切力、膜管的剪切力、設(shè)備內(nèi)表面摩擦力和進(jìn)出口壓力差，原料在系統(tǒng)中循環(huán)的時(shí)間越長(zhǎng)，這些因素的作用應(yīng)越顯著，菌體受到的損害越大。7h循環(huán)實(shí)驗(yàn)表明陶瓷膜過(guò)濾系統(tǒng)對(duì)菌體的活性影響較小。
2.2操作參數(shù)對(duì)膜過(guò)濾的影響
2.2.1過(guò)膜壓力對(duì)過(guò)濾通量的影響
恒定過(guò)濾溫度在23～25℃，切向流速為5m/s，待系統(tǒng)穩(wěn)定后調(diào)定過(guò)膜壓力，記錄過(guò)濾通量和過(guò)膜壓力的數(shù)值。過(guò)濾通量與過(guò)膜壓力關(guān)系見圖1。
由圖1可知，當(dāng)過(guò)膜壓力低于0.75bar時(shí)，膜柱的過(guò)濾通量隨過(guò)膜壓力的增加而增高，當(dāng)過(guò)膜壓力高于0.75bar后，過(guò)濾通量隨過(guò)膜壓力升高而下降。
實(shí)驗(yàn)表明過(guò)濾壓力提高到一定數(shù)值后膜污染趨勢(shì)增快，致使過(guò)濾通量降低。
2.2.2濃縮倍數(shù)與過(guò)濾通量的關(guān)系
取170L原料過(guò)濾濃縮，原料濕重3%(w/w)，原料pH値4133～4135，過(guò)濾溫度23～25℃，切向流速5m/s，過(guò)膜壓力恒定在已確定的數(shù)值0.75bar。在過(guò)濾濃縮過(guò)程中，每濾出20L料液，記錄過(guò)濾通量和濾出液體積，計(jì)算原料濃縮倍數(shù)。濃縮倍數(shù)和過(guò)濾通量的關(guān)系見圖2。
由圖2可見，在23～25℃溫度、切向流速為5m/s、恒壓0.75bar條件下過(guò)濾，隨著濃縮倍數(shù)的增高過(guò)濾通量迅速下降，然后趨于穩(wěn)定。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是發(fā)酵液中存在著大量的細(xì)胞碎片、蛋白和糖等物質(zhì)，高分子物質(zhì)和膠體物質(zhì)在膜表面被截留形成凝膠層，造成過(guò)濾膜污染，使過(guò)濾通量迅速下降。
2.2.3膜過(guò)濾濃縮的效果
在23～25℃溫度、切向流速為5m/s、恒壓0.75bar條件下過(guò)濾，分別對(duì)原料液、5倍濃縮液及透過(guò)液取樣，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)、OD値和pH値檢測(cè)，采集發(fā)酵罐內(nèi)靜置相同時(shí)間的原料作對(duì)照，記錄膜濃縮前后料液特性數(shù)據(jù)，檢查陶瓷膜對(duì)菌體的攔截效率。結(jié)果見表3。
從表3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到，100nm陶瓷膜對(duì)菌體的攔截效率達(dá)到99%以上。
2.3陶瓷膜的清洗
選擇幾種化學(xué)清洗劑清洗污染的過(guò)濾膜，測(cè)定清洗后凈水通量值，考查膜通量的恢復(fù)情況。通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定了陶瓷膜的清洗方法:在60℃條件下，用清水沖洗系統(tǒng)。關(guān)閉濾出閥，用2%的氫氧化鈉和0.5%的次氯酸鈉混合溶液循環(huán)清洗40min。打開濾出閥，繼續(xù)循環(huán)混合液20分鐘，最后用水沖洗至中性。應(yīng)用這種清洗方法可使膜的恢復(fù)率穩(wěn)定在原始凈水通量的90%以上，有效清除膜表面污染物。
3結(jié)論
1)采用100nm精度的Membralox陶瓷膜過(guò)濾濃縮益生菌培養(yǎng)液，可有效攔截菌體，過(guò)濾過(guò)程對(duì)菌體的活性影響較小。
2)在操作溫度23～25℃、切向流速5m/s、過(guò)膜壓力0.75bar的條件下過(guò)濾濃縮益生菌培養(yǎng)液，可增高濃縮倍數(shù)。
3)采用以下清洗方法可使陶瓷膜水通量恢