引言
香菇多糖(lentinan，LNT)是從香菇子實(shí)體中分離得到的一類活性物質(zhì)，研究表明分子量在400000～800000的香菇多糖具有顯著的抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能和抗感染活性[1]，還有研究證明其對(duì)艾滋病有很好的療效，在臨床上具有很好的應(yīng)用前景。香菇多糖的藥效與多糖的分子量及純度有很大關(guān)系。目前已報(bào)道的分離純化香菇多糖的方法有有機(jī)溶劑沉淀法[2]、離心沉淀色譜法[3]、陰陽(yáng)離子交換樹(shù)脂法[4]、酶解法[5]、凝膠層析法[6]等，但有機(jī)溶劑法易引入有害物質(zhì)，安全性受到質(zhì)疑;色譜法設(shè)備昂貴、復(fù)雜，成本太高;酶解法簡(jiǎn)單易行，收率卻不高;而離子交換法僅對(duì)兩性的蛋白質(zhì)有去除作用，卻不能去除中性雜質(zhì)。近二三十年來(lái)，利用有機(jī)膜超濾來(lái)純化精制香菇多糖的技術(shù)研究倍受人們的關(guān)注，通過(guò)有機(jī)膜超濾可將香菇多糖純度提高到7414%，而將有機(jī)膜超濾和滲濾結(jié)合則可將香菇多糖純度提高到8014%，但實(shí)踐證明有機(jī)膜始終存在著不能解決膜污染、不能抗高壓和高溫等問(wèn)題[10]。
本文以45%的香菇多糖粗品為研究對(duì)象，先用活性炭預(yù)處理，再用陶瓷膜超濾法進(jìn)行純化精制。采用合適孔徑的無(wú)機(jī)陶瓷膜超濾來(lái)純化香菇多糖，既體現(xiàn)了超濾無(wú)相變、無(wú)溶劑污染、容易保持生物分子的活性、操作簡(jiǎn)單可靠等優(yōu)點(diǎn)，又可彌補(bǔ)有機(jī)膜的諸多缺點(diǎn)。
1材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)材料
45%香菇提取物，上海康舟真菌多糖公司;次氯酸鈉，D2無(wú)水葡萄糖、苯酚、考馬斯亮藍(lán)G2250、活性炭、磷酸，化學(xué)純，北京化學(xué)試劑公司;牛血清白蛋白，Sigma公司。
1.2實(shí)驗(yàn)儀器
陶瓷膜超濾裝置膜截流分子量50000，膜組件形式管式，江蘇久吾高科;UV22800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海日立有限公司;GL220G高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;真空低溫冷凍干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)儀器公司;BS223S電子天平，北京Sar2torius儀器系統(tǒng)有限公司。
1.3實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1藥液的制備
將45%的香菇多糖粗品，在37℃水浴條件下溶于去離子水配制成415mg/mL的香菇多糖粗品溶液，冷卻至常溫，抽濾除去不溶物，測(cè)定其蛋白質(zhì)含量、多糖含量[12]及色值[13]。
1.3.2不同量的活性炭預(yù)處理藥液
將活性炭用90%的乙醇浸泡2h，抽濾;再用去離子水浸泡攪拌2h，抽濾，重復(fù)2次后烘干備用。取5份100mL/份藥液，加入不同量的處理后的活性炭，攪拌2h，靜置015h后抽濾。測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)含量、多糖含量及色值后將濾液放入真空干燥低溫冷凍箱干燥[2]得多糖干制品，稱重，計(jì)算多糖純度和收率。
1.3.3陶瓷膜超濾
將415mg/mL的香菇多糖粗品溶液加1%的活性炭，攪拌5h，靜置015h后抽濾。將抽濾液在不同的超濾溫度、跨膜壓差和膜面流速下進(jìn)行超濾。每次試驗(yàn)取500mL抽濾液裝入料槽中，開(kāi)泵超濾，開(kāi)機(jī)穩(wěn)定后，量取4min內(nèi)的濾過(guò)液，重復(fù)3次求平均值，計(jì)算超濾通量[13]。將截流液進(jìn)行全循環(huán)，當(dāng)濾出液體積達(dá)到400mL時(shí)，往料槽中加入100mL蒸餾水，繼續(xù)超濾，直到濾出液體積達(dá)到500mL為止。將截流液測(cè)定蛋白含量及多糖含量后放入真空低溫冷凍干燥箱得多糖干制品，稱重，計(jì)算多糖純度和收率。
2結(jié)果與討論
2.1活性炭用量對(duì)香菇多糖粗品純化效果的影響
香菇多糖粗品中成分復(fù)雜，除了有效成分香菇多糖外，還含有大量的寡糖、有機(jī)大分子色素、蛋白質(zhì)等，這些無(wú)效成份不僅對(duì)香菇多糖的純度、成色有很大的影響，還增加了超濾過(guò)程的能耗。依據(jù)活性炭對(duì)有機(jī)大分子色素以及蛋白質(zhì)等雜質(zhì)具有較強(qiáng)的吸附能力的特點(diǎn)[14]，用不同量的活性炭處理香菇多糖粗品溶液，純化結(jié)果如圖1所示。
由圖1(a)可以看出，活性炭脫色效果隨其用量的增加而增強(qiáng)，在0～1%范圍內(nèi)脫色效果增強(qiáng)幅度較大，此后增強(qiáng)幅度減小，當(dāng)活性炭用量增加到1.5%時(shí)，脫色率趨于穩(wěn)定，多糖溶液已基本無(wú)顏色，溶液澄亮。在圖1(a)中還可以看出無(wú)論活性炭用量多少，蛋白質(zhì)去除率基本上都在10%左右，說(shuō)明活性炭只對(duì)很少一部分蛋白質(zhì)有吸附作用，不能作為主要的除蛋白方法。
由圖1(b)可以看出，隨著活性炭用量的增加，除雜率不斷上升，多糖干制品中的多糖純度也隨之增大，但同時(shí)多糖損失也不斷增加，多糖收率隨之降低。當(dāng)活性炭用量大于1%時(shí)，干制品中多糖純度基本趨于穩(wěn)定，但多糖收率卻降低不少，說(shuō)明活性炭吸附色素等雜質(zhì)的同時(shí)，將一部分的香菇多糖也吸附了，而且當(dāng)溶液中雜質(zhì)越少時(shí)增加活性炭用量，多糖損失越大。綜合考慮，1%的活性炭用量為最優(yōu)。
2.2超濾條件的確定
2.2.1不同膜面流速下跨膜壓差對(duì)膜通量的影響在3.3K下，選擇截留分子量為50000的濾膜對(duì)香菇多糖粗品溶液進(jìn)行超濾。不同的膜面流速(u)下，壓差對(duì)膜通量的影響見(jiàn)圖2。
當(dāng)壓差小于0105MPa時(shí)，即使膜面流速再大，膜通量也很小，說(shuō)明在此范圍內(nèi)，壓差是影響膜通量的主要因素;當(dāng)壓差為0105～012MPa時(shí)，壓差大、膜面流速高的料液通量明顯大于小壓差、低流速時(shí)的通量，這是由于壓力的增大和膜面流速的提高都可使溶液通過(guò)濾膜的動(dòng)力增大，故通量明顯增大;當(dāng)壓差達(dá)012～013MPa時(shí)，膜通量基本趨于恒定，若繼續(xù)增大壓力，則耗能高，不經(jīng)濟(jì);膜表面濃差極化效應(yīng)增加，導(dǎo)致通量增加減少;并且通透性越高，一部分香菇多糖分子隨雜質(zhì)透過(guò)，導(dǎo)致收率降低。綜合考慮，選擇超濾壓差為012MPa。
2.2.2膜面流速對(duì)膜通量的影響
在3.3K、012MPa下對(duì)香菇多糖粗品溶液進(jìn)行超濾，膜面流速對(duì)膜通量的影響如圖3。膜面流速越高，膜通量衰減越小，超濾穩(wěn)定時(shí)的膜通量越大。這是由于膜面流速提高時(shí)，對(duì)膜表面的沖擊比較大，減小了膜表面濃差極化效應(yīng)，使得膜通透性提高，膜通量增大。由圖3可以看出，當(dāng)膜面流速大于415m/s時(shí)，膜通量隨流速增加而增加的幅度已非常微小，結(jié)合2.2.1節(jié)結(jié)果，選擇膜面流速為415m/s。
2.2.3超濾溫度對(duì)膜通量的影響
調(diào)節(jié)膜面流速415m/s、跨膜壓差012MPa對(duì)香菇多糖粗品溶液進(jìn)行超濾，溫度對(duì)膜通量的影響見(jiàn)圖4。相同條件下，溫度越高，膜通量越大。這是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)，溫度升高使溶液黏度下降，擴(kuò)散系數(shù)和傳質(zhì)系數(shù)增大，且多糖溶解度增大，濃差極化效應(yīng)減小，故通量在高溫時(shí)較大。但考慮到多糖在高溫下可能會(huì)分解成單糖而影響多糖收率，而且超濾溫度越高能耗越高。綜合考慮，選用40℃為超濾溫度。
2.3陶瓷膜超濾與有機(jī)膜超濾的比較
將經(jīng)過(guò)1%活性炭預(yù)處理，在超濾溫度40℃、跨膜壓差0120MPa、膜面流速415m/s下超濾得到的香菇多糖粗品溶液測(cè)定蛋白含量和色值，計(jì)算得多糖粗品脫色率為9812%，蛋白質(zhì)去除率為81.0%;然后放入真空低溫冷凍干燥箱得多糖干制品，稱重，計(jì)算得其多糖純度為8917%，收率為7716%。比通過(guò)有機(jī)膜超濾香菇多糖的純度[8]提高了1512%，比有機(jī)膜超濾和滲濾結(jié)合純化香菇多糖的純度[9]提高了913%。
由于有機(jī)膜材質(zhì)為高分子材料，形成有機(jī)膜的中空纖維絲強(qiáng)度低，在一定壓力下易變形，且在溶劑中易溶漲，從而影響膜的分離性能;而陶瓷膜由無(wú)機(jī)氧化物在高于1800℃高溫?zé)Y(jié)而成，膜孔為剛性，不易被壓縮變形，在溶劑中不會(huì)發(fā)生溶脹，穩(wěn)定性好，分離性能穩(wěn)定。
另外，有機(jī)膜結(jié)構(gòu)為海綿狀或雙皮層，這種結(jié)構(gòu)在超濾過(guò)程中易于堵塞，清洗困難，且容易被壓實(shí)而形成不可逆的膜污染，從而導(dǎo)致膜通量迅速降低、膜分離性能不穩(wěn)定。而陶瓷膜具有多層不對(duì)稱結(jié)構(gòu)的微孔，不易形成深層污染，在超濾過(guò)程中膜通量穩(wěn)定，純化效果良好。且由于陶瓷膜優(yōu)越的耐酸堿、耐高溫特性，對(duì)于絕大多數(shù)污染物，均可以采用一種適當(dāng)?shù)那逑磩⑶逑垂に囀鼓ぴ偕挥每紤]清洗劑對(duì)膜材質(zhì)本身的影響。另外，非對(duì)稱結(jié)構(gòu)的陶瓷膜還可采用反沖的方法清除膜表面污物。
3結(jié)論
用1%活性炭對(duì)香菇多糖粗品預(yù)處理后，采用截留分子量為50000的陶瓷膜超濾。超濾條件為溫度40℃、跨膜壓差0120MPa、膜面流速415m/s。在此條件下，多糖粗品脫色率達(dá)9812%，蛋白質(zhì)脫除率為81.0%，多糖純度從45%提高到8917%，收率為7716%。