一、概述

Bt即蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）的簡稱，是一種寄生于昆蟲體內引起昆蟲發病死亡的能產生伴孢晶體的芽孢桿菌，其制劑廣泛應用于農、要、果、蔬、城市園林方面的害蟲防治。

二、生產工藝操作規程

（一）砂土管菌種的制備

1、砂的處理：

取建筑用砂或河砂經60－80目過篩后用工業Hc浸泡48h后用清水洗凈，再用0.2NNao中和，烘干后用磁鐵除去其中帶磁性之金屬微粒，裝入潔凈容器內備用。

2、砂土管制備：

將以上已處理好之砂土分裝于1.2×12公分之小試管中，每管約裝2克，塞上棉塞，先用2.0kg/cm2高壓滅菌1.5小時，間歇滅菌三次，再以160℃干熱滅菌2小時，經無菌試驗，即抽取一點砂土置于斜面試管中 36℃培養24小時才檢查無雜菌后備用。

3、砂土孢子的制作：

選擇生長良好，經過生產能力考查合格的優良試管斜菌種一支加入無菌水5ml，用接種針刮下孢子制成高濃度的孢子懸液用無菌吸管吸取 0.2－0.3ml接入砂土管中，而后置入真空干燥器內，用真空泵間歇抽干，用石蠟封口，以后置于0－5℃冰箱中，在干燥情況下保存。

（二）斜面菌種的制備

1、培養基：牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、瓊脂2%，調節7.5－8.0溶化后分裝試管，加塞放入試管簍內包好滅菌。

2、滅菌：在消毒鍋內1.1kg/cm2下蒸氣滅菌30分鐘，等冷卻到　　　60－70℃時取出擺成斜面，空白培養2天觀察無雜菌方可使用。

3、接種培養：將菌種試管斜面放在接種室內或無菌操作箱中，打開紫外線燈滅菌30分鐘后關閉。用接種環按操作規程刮取種子菌苔少許，轉至新鮮斜面培養基上劃線接種，然后放入30℃培養箱內3－4天，經檢查正常，放入冰箱內備用。

（三）扁瓶擴大種子制備

1、培養基：同斜面培養組成，另加葡萄糖1%，溶化后裝入扁瓶。

2、滅菌、接種、培養均與斜面菌種同。

（四）發酵

1、培養基棉籽餅粉3.5%；玉 米 粉2.0%；魚 粉1.0%；酵 母 粉0.2%；CaCO30.1%；泡 敵0.03%用NoaH調PH8.5 消毒后為7.0左右。

2、滅菌：發酵罐在投料之前清洗干凈，按投料系數50%投料，分過濾器以2kg/cm2滅菌30分鐘，實罐滅菌1.1kg/cm2，罐溫121－125℃，保持30分鐘（按滅菌操作步驟進行）。

3、孢子懸浮液準備：取培養好的扁瓶種子3－4個分別加入無菌水，將菌苔洗成懸液，再倒入接種瓶內，配上注射針頭。將此孢子懸液進行水浴75℃20分鐘處理。

4、接種：通過發酵罐接種孔利用壓差將孢子懸液注入發酵罐中。

5、培養：罐壓保持0.3－0.5kg/cm2，攪拌220轉/分鐘，通氣量在接種后4小時前小些，逐步增至1：1，溫度30℃±1℃。

在上述條件下菌體生長發育經歷期為：0－4小時，調整生長期；5－12小時，生長繁殖期；13－20小時，芽孢晶體形成期；21－放罐，芽孢晶體成熟期。

6、檢測：培養過程4、8、12、16、20……各取樣檢測生長情況、PH值，最后一次取樣進行菌數測定。

（五）發酵液的后處理

1、將發酵好的發酵液用工業鹽酸調至PH5.0－6.5。

2、用薄膜濃縮器（或離心機）進行真空濃縮。

3、檢測：根據發酵液的含菌數及濃縮倍數估算含菌數100億/毫升取樣檢測，化驗符合產品質量標準時即可終止濃縮，壓入貯罐。

4、添加劑：按規定添加NaCl1%，苯甲酸鈉0.3%攪拌均勻。

5、成品檢驗：

（1）成品經質檢部門檢驗各項指標達產品質量標準后，下達包裝通知。

（2）包裝：采用1立升塑料瓶包裝，瓶有內外蓋，不泄漏，包包裝應符合產品庫存、搬運和運輸過程的技術和安全需要，箱內應有產品合格證和使用說明書。

四、Bt乳劑主要生產設備一覽表：

附件一：Bt乳劑質量檢驗方法：

A、Bt乳劑芽孢數的測定：

A1原理

利用血球計數板在光學顯微鏡下，數出芽孢數，再用公式算出每1毫升產品中含芽孢數。

A2儀器

血球計數板、光學顯微鏡等。

A3操作

A3·1晶體處理

將待測樣品搖勻后迅速吸取10毫升于等量的0.5N的NaoH溶液中，間歇搖動，處理1－2小時，使晶體全部自溶，直至顯微鏡檢查無晶體為止。

A3·2稀釋

在500毫升三角瓶（內裝玻璃珠）中，裝入99.5毫升無菌水，將經NaoH處理過的樣品搖勻后迅速用吸管吸取0.5毫升于三角瓶中（即共稀釋400倍）。

A3·3制片

用無菌吸管從充分搖勻的400倍稀釋液中吸取少許，從蓋玻片的一端注入血球計數板，使菌液沿玻片間滲入，并用濾紙吸干槽中流出多余菌液，操作過程中血球計數板不得產生氣泡，否則應重做。靜置15分鐘后再計數。

A3·4觀察讀出芽孢數

制好片后用低倍鏡觀察，用25×16的計數板，數四個角上的四個中方格和中間的一個中方格的芽孢數，然后再換算成1毫升菌液中的總芽孢數。

A4計算

每1毫升產品中含芽孢數其計算方式如下：A＝B×C×5×104式中，A為樣品1毫升菌液的芽孢數（億個/毫升）。B為五個中方格含芽孢總數。C為稀釋倍數。5×104為常數即血球計數板每中格體積的含菌數換算成1毫升含菌數。

注：如果用16×25血球計數板計數，則用下面公式進行計算：A＝B×C×3.2×104

B、Bt乳劑和毒效測定：B1供試蟲采集：人工飼養或野外采集（在特定區域范圍內，同一株植物上收集），齡期一致（一齡或二齡），生長發育良好的健康昆蟲（常用菜青蟲，但要避免在噴藥不久的作物上采取），在室內觀察1－2天后備用。B2一切用具洗凈，用1kg/cm2蒸汽滅菌30分鐘，備用。

B3操作

B3·1將樣品稀釋500、1000、1500、2000倍，每個濃度設3個重復。

B3·2用300px培養皿或罐頭瓶作容器，其中放2－3片白菜葉，將菌液涂在菜片上（正、反兩面），晾干后放入20－25頭二齡菜青蟲，同時作一組對照組。

B3·3在27－28℃光照下，飼養試驗幼蟲。

B4結果記錄

試驗后24、48、72小時分別觀察和記錄死活蟲數以及蟲體化蛹數，并將觀察結果列入下表

Bt乳劑致病率測定記錄表

B5計算

根據上表所列數據計算72小時菜青青菜蟲死亡率，其計算方法按下面公式進行：

死亡蟲數

死亡率（%）＝ ×100

供試昆蟲

注1：在計算和統計過程中，化蛹蟲數不參與死亡率計算。

注2：若對照組死亡率>5%，應校正其死亡率，其校正方法如下：

對照組活蟲數－處理組活蟲數

校正死亡率（%）＝ ×100

對照組活蟲數

注3：若無菜青蟲，可用二齡家蠶代之，檢驗方法不變。

C、PH值測定：

采用精密PH試紙測定。

附件二：

Bt制劑使用說明書

【簡 介】 本品為高效微生物殺蟲劑。具有對人畜無害，不傷天敵、無污染、價廉等特點。可廣泛使用于農、林、果、蔬、城市園林方面的害蟲防治，在建立無公害蔬菜、煙草、茶葉經濟作物區上，尤其具有極為良好的推廣價值。實踐證明，我廠生產的Bt乳劑，不僅殺蟲效果顯著，藥效期長，而且帶來了廣泛的社會效益和生產效益。完全可以取代鉀胺磷等部分劇毒農藥。

【性 狀】 液劑型（粘稠乳狀液體）

【規 格】 每毫升含孢子數100億以上，孢子比1：1。

【用途用量】 畝用量一般2公兩。兌水低量噴霧。具體參照下表：

注：（1）加入少量化學農藥可增效；（2）本品有效期一年。忌暴曬和高溫