摘要：目的運用超分子印跡模板作用規律對金銀花和山銀花體外印跡等效性進行研究，旨在為金銀花和山銀花兩花紛爭提供新的解決方法。方法以金銀花藥渣、山銀花藥渣、菊花藥渣為主體分子，以金銀花、山銀花、雙黃連（金銀花）、雙黃連（山銀花）、銀翹散（金銀花）、銀翹散（山銀花）水提液為客體分子，3種主體分子和6種客體分子進行選擇性吸附。采用HPLC法對吸附前后的客體分子水溶液指紋圖譜進行測定。運用總量統計矩法計算總量一階矩及其差值，并對差值進行t檢驗。結果6種客體分子分別被金銀花與山銀花主體分子組、金銀花與菊花主體分子組、山銀花與菊花主體分子組吸附后，其總量一階矩差值經t檢驗，P1＝0.94＞0.05、P2＝0.02＜0.05、P3＝0.04＜0.05。所有客體分子分別被金、山銀花主體分子吸附后，其總量一階矩差值無顯著性差異。而被菊花主體分子吸附后，與被金銀花和山銀花主體分子吸附后相比均存在顯著性差異。結論金銀花和山銀花之間印跡模板具有相似性，而金銀花和山銀花與菊花之間印跡模板存在差異。說明金銀花和山銀花二者存在印跡等效性，這也與臨床用藥相符合。

“印跡等效性”是指二者具有不同化學結構而體現相同（似）“印跡模板”作用規律的現象，臨床上則表現為異質等效，即不同物質產生相同作用效果的現象。金銀花和山銀花在我國資源豐富，藥用歷史悠久。二者原同屬金銀花，《中國藥典》2005年版將其分列。至此，南北“兩花”紛爭開始上演，紛爭表象看似是正本清源，然實質卻是中藥異質等效規律的求證。

金銀花主產于山東、河南等北方種植區，山銀花主要分布在湖南、四川、廣東等南方種植區[1]，且二者的外觀性狀也存在較大區別[2-3]。除此以外，金銀花和山銀花物質成分種類及含量亦不盡相同，從現有文獻統計，在化學成分組成方面，金銀花較山銀花含有更豐富的環烯醚萜類和黃酮類化合物，山銀花較金銀花含有更為豐富的三萜皂苷類化合物。在各類化學成分含量方面也存在明顯差異[4-16]，山銀花中綠原酸類化合物含量明顯高于金銀花，金銀花中木犀草苷、蘆丁、忍冬苷、木犀草素-7-O-β-D-半乳糖苷含量遠高于山銀花。例如，山東平邑金銀花中木犀草苷質量分數為0.073 9%，而湖南懷化的山銀花中沒有檢測到木犀草苷，重慶秀山的山銀花綠原酸質量分數高達9.03%，遠高于山東平邑金銀花中綠原酸4.08%的含量[17-18]。在微量元素方面，金銀花中鐵（Fe）與鎳（Ni）含量高于山銀花，而山銀花中錳（Mn）含量高于金銀花[19]。盡管金、山銀花在地域分布、外觀形態、藥效物質種類和含量上存在差異，但兩者在性味與歸經、功能與主治甚至用法與用量中均為一致，這點在中醫臨床長期實踐過程及藥典中可得到充分證實[20]。然而為何會產生這種現象，為何擁有不同種類、不同數量化學成分的2味中藥，在臨床上卻能產生相同的治療效果。不難看出，金銀花和山銀花的藥理作用除了遵循傳統的藥理學作用規律外，還應有特殊作用規律即異質等效規律，也就是中藥多成分所產生的藥理綜合作用是諸成分印跡模板對人體印跡作用的結果，具體可用超分子印跡模板理論來闡明。

印跡模板理念來源于Fischer酶與底物作用的鎖鑰模型以及Pauling的抗體形成學說，類似于藥理學經典的受體-配體理論，能夠用于解釋受體-配體理論。但與其又存在差異，是指以特定模板分子為客體分子，尋找及制備出對該客體分子具有特異選擇性主體分子的過程，屬于超分子化學中主客體化學研究范疇，能體現自組織、自組裝、自識別與自復制的特點[21-27]。超分子印跡模板概念是化學上的分子結構概念，是在空間結構和結合位點上能完全匹配的模板物，對中藥成分來說既是其分子結構的空間活性結構，也可以說是活性原子團的空間排列點陣，能從化學物質的本源上說明主客體分子（在一定程度下是受體-配體理論）的普遍作用規律。例如，哌替啶、嗎啡、美沙酮、噴他佐辛、芬太尼等均可與腦啡肽競爭性結合作用于大腦阿片受體，起到同樣的中樞鎮痛作用，然而這眾多鎮痛藥的結構與腦啡肽的結構相差千里[28]。這就說明產生同樣的藥理作用可以是不同的物質結構，因此單用受體-配體、結構-配體理論不能做深層次解析，自然只能將嗎啡肽受體的3點結合抽象成印跡模板的空間結構表達。且大量的生物超分子化學表明，來源于動植物的中藥是一個巨大的超分子體系，是自然界分子社會按印跡模板自主作用的結果[29]。因此，對于金銀花和山銀花的異質等效現象只能用高于經典的構效關系的超分子印跡模板理論來闡述其所在核心之所在：不同物質可以相同印跡模板作用于相一致印跡模板的病證，而這種印跡模板的作用特征可以通過體外的印跡交叉實驗來進行驗證。

1實驗原理

基于中藥超分子理論，中藥主客體分子的分離實質即從巨復的中藥超分子體系中洗脫模板小分子保留母體印跡模板的過程，包括中藥成分提取和溶出。因此，通過對金銀花和山銀花成分的充分提取和溶出即可實現其超分子主客體分子分離的過程。本實驗在對金銀花和山銀花主客體分子進行分離后，可得到藥渣（主體分子）及金銀花和山銀花提取液（客體分子）。因菊花以花入藥，且具有清熱解毒的作用，所以其藥渣被選為本實驗的陰性對照。同時在金銀花、山銀花單味藥的基礎上增加了雙黃連與銀翹散處方，選其水提取液參與實驗。為驗證金銀花和山銀花印跡等效性，探討主體分子對客體分子的選擇吸附性，使金銀花、山銀花、菊花藥渣與金銀花、山銀花、雙黃連（金銀花）、雙黃連（山銀花）、銀翹散（金銀花）、銀翹散（金銀花）水提液進行選擇性吸附，再采用HPLC法測定吸附前后水提液的指紋圖譜。

統計矩原理為非房室模型分析方法，可通過總量零階矩（AUC）、總量一階矩（MRT）、總量二階矩（VRT）對中藥及其復方指紋圖譜進行分析。其中零階矩表示血藥濃度-時間曲線下面積，即整個指紋圖譜的峰面積和；一階矩為平均駐留時間，即整個指紋圖譜所有峰重心的位置；二階矩為平均駐留時間的方差，即指紋圖譜中每個峰與峰重心的距離。較之其他指紋圖譜分析方法，該法具有抗干擾性、加和性、偶聯性的特點[30-32]。一直以來，本團隊致力于將總量統計矩法運用于中藥及其復方的指紋圖譜分析中，也取得了較好的成效。賀福元等[33]采用HPLC法對不同產地大黃指紋圖譜進行測定，運用總量統計矩法對其進行分析，發現通過一階矩可以定性識別大黃；胡超等[34]通過總量統計矩法對不同批次片仔癀指紋圖譜進行分析，所建立的片仔癀指紋圖譜重復性好、準確度高、特征性強。除此以外，楊巖濤等[35]、周晉等[36-37]、謝相貴等[38]也對其進行了研究，證實了該法可對中藥及其復方指紋圖譜進行定性定量分析，準確度較好。

本實驗通過計算實驗后所有指紋圖譜一階矩、原客體分子與被不同主體分子吸附后相應客體分子指紋圖譜一階矩差值，比較相同客體分子被不同主體分子吸附后其指紋圖譜的變化情況。以此來探討3種主體分子是否存在相同印跡模板，從而對金銀花和山銀花的印跡模板等效性進行評價。

2試藥與儀器

2.1試藥與試劑

金銀花LoniceraeJaponicae Flos（忍冬科忍冬屬植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花）、菊花Chrysanthemi Flos（菊科菊屬植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥頭狀花序）、雙黃連處方［金銀花、黃芩Scutellariae Radix（唇形科黃芩屬植物黃芩Scutellariabaicalensis Georgi的干燥根）、連翹Forsythiae Fructus（木犀科連翹屬植物連翹Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl的干燥果實）］、銀翹散處方［金銀花、連翹、薄荷Menthae Haplocalycis Herba（唇形科薄荷屬植物薄荷Mentha haplocalyx Briq.的干燥地上部分）、荊芥Schizonepetae Herba（荊芥Schizonepeta tenuifoliaBriq.的干燥地上部分）、淡豆豉Sojae Semen Praeparatum（豆科大豆屬植物大豆Glycine max(L.)Merr.的成熟種子的發酵加工品）、牛蒡子Arctii Fructus（菊科牛蒡屬植物牛蒡Arctium lappa L.的干燥成熟果實）、桔梗Platycodonis Radix（桔梗科桔梗屬植物桔梗Platycodongrandiflorus(Jacq.)A.DC.的干燥根）、淡竹葉Lophatheri Herba（禾本科淡竹葉屬植物淡竹葉Lophatherumgracile Brongn.的干燥莖葉）］。以上藥材及處方中藥材均委托湖南中醫藥大學附屬醫院藥劑科定點采購，山銀花Lonicerae Flos（灰氈毛忍冬Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.的干燥花蕾或帶初開的花）購于湖南省隆回縣，并由湖南中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室石繼連副教授按《中國藥典》2015年版一部有關項下進行鑒別，結果均為正品。乙腈為色譜純，水為自制超純水。

2.2儀器

Waters1525 BinaryHPLC Pump、Waters2489UV/Visible Detector、Breeze工作站，美國Waters公司；RE-200B型旋轉蒸發儀，鞏義市予華儀器有限責任公司；SHB-IIIAS型循環水式真空泵、ZDHW型調溫電熱套，北京中興偉業儀器有限公司；YP-B10001型電子天平，上海光正醫療儀器有限公司；DFY-400搖擺式高速中藥粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司；DZF-6050真空干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；SK3300H型超聲清洗器，上海科尋超聲儀器有限公司；TS-A脫色搖床，金壇市中大儀器廠；移液槍，雪蓓醫療設備有限公司。

3方法

3.1色譜條件

色譜柱為Ultimate AQ-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為0.4%磷酸水溶液-乙腈，梯度洗脫：0～5 min，5%～8%乙腈；5～25 min，8%～20%乙腈；25～35 min，20%～22%乙腈；35～45 min，22%～30%乙腈；45～50 min，30%～36%乙腈；體積流量1.0 mL/min；進樣量10μL；檢測波長238 nm；柱溫30℃。各成分理論塔