真空冷凍干燥保藏法這種菌種保藏方法的保藏期長（約5年以上）、變異小、適用范圍廣，是目前較理想的保藏方法，是各保藏機構廣泛采用的主要保藏方法。例如，曾報道ATCC保藏的6500多株菌種中，僅有不到100株無法用這個方法保藏。其原理是創造干燥和低溫的保藏環境。基本方法是在較低的溫度（-15℃）下快速將微生物細胞或孢子凍結，保持菌種的細胞完整，然后在減壓情況下使水分升華，這樣使細胞的生長代謝等生命活動處于停止狀態，得以長期保藏。

其操作步驟如下：

① 安瓿管的處理

安瓿管的內徑一般為8～10mm，長度不小于100m。先用毛細管加入洗滌液浸泡過夜，再用蒸餾水洗干凈后烘干，瓶口加棉花塞好，并用紙包上，121℃滅菌30min，取出在60℃烘箱中干燥備用。

② 保護劑

其作用是保持菌種細胞的生命狀態，盡量減少冷凍干燥時對微生物引起的凍結損傷。保護劑還可以起支持作用，使微生物疏松地固定在上面。保護劑可采用低分子和高分子化合物，如氨基酸、有機酸、糖類、蛋白質、多糖等。常用的有脫脂牛奶和血清。如馬血清或馬血清加入7.5%的葡萄糖。保護劑用之前采用適當的方法滅菌。

③ 菌懸液制備

應該用最適的培養條件（如培養基、溫度、培養時間等）培養菌種，以獲得良好的培養物用于長期保藏。培養時間應掌握在生長后期，因為對數生長期的細胞對冷凍干燥的抵抗力較弱；產孢子的微生物須適當延長培養時間以期獲得成熟的孢子。一般細菌培養 24～48h，酵母72h，放線菌和絲狀真菌7～10d以上。操作時，在無菌條件下先將少量保護劑加入斜面，輕輕刮下菌苔或孢子，制成菌懸液。用毛細滴管取0.1～0.2ml菌懸液加進滅好菌的安瓶管中，塞好棉花塞。  

④ 冷凍干燥

冷凍溫度達-15℃～-30℃即可。裝入菌懸液的安瓿管應盡快冷凍，以防菌體沉淀為不均勻的菌懸液以及微生物的再次生長或萌發孢子。達到冷凍溫度后，立即啟動真空泵，在15min內使真空度達到66.661Pa。真空度上升至13.3322 Pa以上，可以升高溫度至25～30℃。此時由于升華還在繼續，樣品不會融化。干燥完畢后，關閉真空泵，排氣，取出安瓿管在多孔管道上再抽真空并封口。

⑤ 安瓿管的保藏

安瓿管在4～5℃溫度下可保藏5～10年，室溫下保藏效果不佳。影響保藏效果的因素除菌種、菌齡外，還與樣品中的含水量直接有關，通常含水量在1%～3%時保藏效果較好，5%～6%時保藏效果相應降低，含水量達到10%以上，樣品就很難保藏。